Acordando em um laboratório aparentemente vazio, o jogador é obrigado a completar vários desafios de quebra-cabeça baseados em física através de inúmeras câmaras de teste, a fim de testar o novo Dispositivo de Portal Portátil da Aperture Science, sem uma explicação de como, por que ou por quem.

O enredo de Portal é revelado ao jogador através de mensagens de áudio ou "anúncios" de GLaDOS e elementos visuais dentro de salas encontradas em níveis posteriores. De acordo com The Final Hours of Portal 2, o ano é estabelecido para ser "em algum lugar em 2010"- doze anos após a Aperture Science ter sido abandonada. O jogo começa com Chell acordando de uma cama de estase e ouvindo instruções e avisos da GLaDOS, uma inteligência artificial, sobre os próximos testes. Chell entra em câmaras distintas que introduzem os jogadores à mecânica do jogo, sequencialmente. Os anúncios de GLaDOS servem como instruções para Chell e ajudam o jogador a progredir no jogo, mas também desenvolvem a atmosfera e caracterizam a IA como uma pessoa. Chell recebe bolo como recompensa se completar todas as câmaras de teste. Chell prossegue através do Centro de Enriquecimento vazio, com GLaDOS como sua única interação. À medida que o jogador se aproxima da conclusão, os motivos e o comportamento de GLaDOS se tornam mais sinistros; embora ela tenha sido projetada para parecer encorajadora, as ações e a fala de GLaDOS sugerem falta de sinceridade e desrespeito insensível pela segurança e bem-estar dos sujeitos do teste. As câmaras de teste se tornam cada vez mais perigosas à medida que Chell prossegue, testes incluindo um curso de tiro real projetado para androides militares, bem como algumas câmaras inundadas com um líquido perigoso. Em outra câmara, GLaDOS observa a importância do Weighted Companion Cube, uma caixa na altura da cintura com um único grande coração rosa em cada rosto, para ajudar Chell a completar o teste. No entanto, GLaDOS declara que deve ser sacrificado em um "incinerador de inteligência de emergência" antes que Chell possa continuar. Algumas câmaras posteriores incluem torres automatizadas com vozes infantis (também dubladas por McLain) que disparam contra Chell, apenas para simpatizar com ela depois de ser destruída ou desativada. Depois que Chell conclui a câmara de teste final, GLaDOS manobra Chell em um incinerador na tentativa de matá-la. Chell escapa com a arma de portal e atravessa as áreas de manutenção dentro do Centro de Enriquecimento. GLaDOS entra em pânico e insiste que ela estava fingindo matar Chell como parte do teste. GLaDOS então pede a Chell que assuma a "posição de submissão da escolta do grupo", deitada de bruços no chão, para que um "associado do grupo" possa levá-la à sua recompensa, mas Chell continua sua fuga. Nesta seção, GLaDOS comunga com Chell quando fica claro que a IA matou todos os outros no centro. Chell atravessa as áreas de manutenção e os espaços vazios do escritório atrás das câmaras, às vezes seguindo mensagens de grafite que apontam na direção certa. Essas áreas de bastidores, que estão em um estado extremamente dilapidado, contrastam fortemente com as câmaras de teste imaculadas. O grafite inclui declarações como "o bolo é uma mentira" e pastiches do poema de Emily Dickinson "The Chariot", "The Reaper and the Flowers" de Henry Wadsworth Longfellow e "No Coward Soul Is Mine" de Emily Brontë, referindo-se e lamentando a morte do Cubo Companheiro. GLaDOS tenta dissuadir Chell com ameaças de danos físicos e declarações enganosas à medida que Chell se aprofunda nas áreas de manutenção. Chell chega a uma grande câmara onde o hardware de GLaDOS paira sobre a cabeça. GLaDOS continua a ameaçar Chell, mas durante a troca, uma esfera cai de GLaDOS e Chell a joga em um incinerador. GLaDOS revela que Chell acabou de destruir o núcleo da moralidade ou sua consciência, um dos múltiplos "núcleos de personalidade" que os funcionários da Aperture Science instalaram após a IA inundar o centro de enriquecimento com gás neurotoxina. Com ele removido, ela pode acessar seus emissores novamente. Uma contagem regressiva de seis minutos começa quando Chell desaloja e incinera mais núcleos de personalidade de GLaDOS, enquanto GLaDOS a desencoraja verbalmente, com provocações e insultos juvenis, e fisicamente disparando foguetes contra ela. Depois que Chell destrói o último núcleo de personalidade, um mau funcionamento destrói a sala e transporta tudo para a superfície. Chell é então visto deitado do lado de fora dos portões da instalação em meio aos restos mortais de GLaDOS. Após o anúncio do Portal 2, o final foi expandido em uma atualização posterior. Nessa continuidade retroativa, Chell é arrastada para longe da cena por uma entidade invisível falando com uma voz robótica, agradecendo-lhe por assumir a "posição de submissão da escolta do grupo". A cena final, depois de um longo e rápido zoom pelas entranhas da instalação, mostra um bolo da Floresta Negra e o Cubo Companheiro Ponderado, cercado por uma mistura de prateleiras contendo dezenas de núcleos de personalidade aparentemente inativos. Os núcleos começam a acender, antes que um braço robótico desça e apague a vela do bolo, fazendo com que a sala apague. À medida que os créditos passam, GLaDOS entrega um relatório final: a música "Still Alive", que declara que o experimento foi um enorme sucesso, além de servir para indicar ao jogador que GLaDOS ainda está viva, que seu núcleo "feliz" não foi desativado.